1985年，葛优拍摄了首部电影《盛夏和她的未婚夫》，正式进入影视圈。1988年，葛优在影片《顽主》中
扮演杨重一角，获得第9届中国电影金鸡奖最佳男主角提名；同年他在张艺谋执导的电影《代号美洲豹》中饰演一名劫机犯。
1989年，葛优参演了滕文骥执导的电影《黄河谣》，扮演土匪头子黑骨头。1991年，参演电影《
烈火金刚》；同年在黄健中执导的电影《过年》中饰演一位好色又假正经的大姐夫，他凭借此片获得第15届大众电影百花奖最佳男配角奖。
1992年，主演北京电视台推出的电视剧《
编辑部的故事》，片中他饰演的李冬宝一角另其知名度提升；他亦凭借此片获得第10届中国电视金鹰奖最佳男主角奖；同年主演夏刚执导的电影《
大撒把》，获得第13届中国电影金鸡奖最佳男主角奖。
1993年，主演张艺谋导演的电影《
活着》，这部电影是他表演上的转折点。《活着》是以男主角的坎坷命运为主线，时间跨度长，表演幅度大；剧中葛优饰演的福贵是一个嗜赌如命的纨绔子弟，不仅在赌桌上败光了全部家底，也使得老父恼羞成怒散手人寰。同年葛优在陈凯歌执导的电影《
霸王别姬》中饰演袁四爷一角。
1994年，凭借在《活着》中的表演，葛优获得第47届戛纳国际电影节最佳男主角奖，成为首位获此殊荣的华
人演员。1996年他与姜文合演了周晓文执导的电影《
秦颂》，片中葛优饰演悲剧音乐家高渐离。
1997年，参演由许鞍华执导、改编自张爱玲小说的电影《
半生缘》；同年在冯小刚执导的贺岁片《
甲方乙方》中饰演姚远一角。1998年凭借《甲方乙方》获得第21届大众电影百花奖最佳男演员奖；同年参演冯小刚执导的电影《
不见不散》，片中葛优饰演刘元。
1999年，葛优在冯小刚执导的电影《
没完没了》中饰演出租车司机韩冬。2000年，葛优主演电影《
大腕》，在片中他饰演一位电影厂的下岗摄影师。2002年，葛优凭借在《大腕》的表演获得了第25届大众电影百花奖最佳男主角奖。
2003年，主演冯小刚执导的电影《
手机》，葛优饰演的严守一是一名电视台的主持人，主持《有一说一》的谈话节目，但这个人物在公众面前讲真话，生活之中却说假话。
2004年，凭借电影《卡拉是条狗》获得第27届大众电影百花奖最佳男主角奖；同年出演冯小刚执导的电影《
天下无贼》，饰演盗窃团伙首领胡黎。
2006年，在冯小刚执导的《
夜宴》中饰演有些神经质，同时还有些脆弱的
厉帝。2007年，在刘仪伟执导的《
命运呼叫转移》中饰演纯朴憨厚的农民老三。
2008年，在冯小刚执导的电影《
非诚勿扰》中饰演海归秦奋，与舒淇演绎了寻找真爱的童话。2009年3月，凭借《非诚勿扰》获得第三届亚洲电影大奖最佳男主角；12月担任首届澳门国际电影节评审委员会主席。
2010年，主演陈凯歌执导的电影《
赵氏孤儿》，片中葛优饰演的程婴是一个有悖传统中国宗法伦理规范，弃亲生子不顾，将他人孩子抚育成人的悲情英雄；同年12月16日，葛优与姜文，周润发合演的电影《
让子弹飞》在全国上映。
2011年8月，凭借《赵氏孤儿》获得第14届中国电影华表奖最佳男演员奖；12月与英皇娱乐签下为期五年共三部影片的合约。2013年12月19日，葛优主演的贺岁喜剧电影《私人定制》在全国上映。2014年，主演姜文执导的电影《
一步之遥》，饰演警探项飞田。
